药物靶点鉴定与化学蛋白组学
药物靶点鉴定与化学蛋白组学

       人类基因组计划的顺利实施,使生命科学研究的重心逐渐转移到对生物功能的整体研究上。对生物功能的主要体现者或执行者——蛋白质——的表达模式和功能模式的研究成为生命科学发展的趋势。
       蛋白质组(proteome)这一概念是1995年由澳大利亚学者最先提出来的,源于蛋白质(protein)与 基因组(genome)两个词的杂合,指的在一个特定的时间和空间内,一个基因组、一种细胞组织或一种生物体所表达的全部蛋白质。对蛋白质组问题的研究称之为蛋白质组学(proteomics),主要是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律。
       蛋白质组学具体的研究内容包括:蛋白质定性和定量分析,蛋白质翻译后修饰研究,蛋白质结构研究,蛋白质功能研究,小分子-蛋白质和蛋白-蛋白相互作用研究等。其中定量分析又分为非标记定量(label free)和标记定量(SILAC, iTraq, TMT等)。
       当化学与生物学的最新发展融合,形成了新的交叉研究领域——化学蛋白质组学(chemical proteomics或chemoproteomics)。化学蛋白质组学是一个目前仍在不断扩展中的全新领域,学术界至今对其尚未有确切定义。作为后基因组时代的新技术, 是联系蛋白质组和药物靶点研究及新药研究的桥梁和纽带。基于目前化学蛋白组学的发展方向和研究成果,可以认为,化学蛋白质组学是利用能够与靶蛋白质发生特异性相互作用的化学小分子来干扰和探测蛋白质组, 在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能及其与化学小分子的相互作用, 从而准确找到化学小分子 (包括药物) 的结合部位——作用靶点——的组学研究方法。
       化学蛋白质组学的技术包括: 基 于 活性 蛋 白 质 组 分 析(Activity-based Protein Profiling, ABPP) ,基 于 亲 和 性 蛋 白 质 组 分 析(Affinity-based Protein Profiling, AfBPP) ,蛋白质组热稳定性分析技术(thermal proteome profiling, TPP),依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(Drug affinity responsive target stability, DARTS) ,依赖于限制性酶切的小分子和蛋白的相互作用研究(limited proteolysis -small molecule mapping, LiP-SMap ),基于氧化速率的蛋白稳定性测试(Stability of Proteins from Rates of Oxidation, SPROX),等等。
       礼达建立了基于ABPP和AfBPP的完善的化学蛋白质组学平台,为活性化合物提供靶点的鉴定和验证服务,填补了国内蛋白组学服务领域的这块空白。此外,礼达也承接常规的蛋白质组学服务项目。

礼达提供从活性化合物出发到靶点鉴定的闭环服务
其中探针合成和靶点鉴定为化学蛋白组学定制服务项目

靶点鉴定的重要性
 

为您的化合物找到细胞内的蛋白靶点!


       药物-靶标相互作用的揭示是现代药物发现过程中的关键步骤之一。 化学蛋白质组学可以鉴定活细胞中小分子的特定靶标。 其中,脱靶靶标的鉴定有助于理解和克服旧药的不良反应。 因此,靶点鉴定对于新药的开发、老药的优化或新应用具有重要意义。


靶点鉴定的基本流程

探针合成

 

       对活性分子进行特定化学修饰,得到靶点鉴定探针。修饰的基团包括两部分:一个是交联基团(crosslinking group),用于共价交联靶点蛋白;另一个是报告基团(reporting group),用于后续连接上荧光分子或生物素分子,进而进行成像分析或质谱分析。该探针称为P探针。
       同时,还合成不包含交联基团的探针作为竞争探针,称为C探针,用于竞争性定量蛋白质谱,以提高靶点鉴定的准确度。另外,活性分子及其衍生物也可以作为竞争探针。

 

基于靶点鉴定的更多服务


1、基于凝胶(FL):将待确认的蛋白高表达于细胞中,进行竞争分子浓度梯度的荧光成像。可以绘制出活细胞中的竞争抑制曲线。
2、基于质谱(Silver→MS):制备大批量富集后的蛋白样品,一次性跑SDS-PAGE胶,同时采集荧光和银染图像,对比之后切下目标蛋白条带,经酶解等处理后进行质谱鉴定。此方法适用于高丰度靶蛋白。
3、基于免疫印迹(WB):将待确认的蛋白过表达于细胞中(若蛋白本身表达量较高,则可以用野生型细胞),对富集后的蛋白样品进行western blot成像。加入过量竞争分子作为阴性对照组。(需要有特异性抗体)

 

基于靶点鉴定的更多服务


方法:探针标记蛋白后,使用可断裂biotin-N3试剂富集探针结合的蛋白,蛋白on beads酶解后经处理(如酸处理)使标记肽段从beads上断裂,再进行质谱鉴定。
通过质谱鉴定可以直接获得探针和靶蛋白交联的氨基酸位点信息。
通过所有交联氨基酸位点信息,可以描绘靶蛋白上和化合物结合的口袋,与分子模拟对接结果进行互相印证。

 

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